精密锯锯切跑偏原因分析与解决方法 高君 东北轻合金有限责任 摘要 ：阈锯片精密锯具有锯切精度高、速度快、操作灵活方便等优点，是许 多金属板带生产和加工公司普遍的使用的锯切设备。由于 它承受的工作 负荷较天．并且处在粉尘污染严重的恶劣环境 中，所以会常常会出现各种各样的设备故障。板材锯切 中经常 出现的锯 片跑偏现象，就是 由多种设备故障引起 的。如果不立即处理好 ，不但会损坏设备，而且产生大量废 品，给生产经营带来严重的经济 损失，因此在生产的全部过程 中防止和解决锯片跑偏是很重要的 关键词 ：精 密锯 锯片跑偏 解决办法 一 、 锯片跑偏给生产带来的危害 掉齿和跑偏 圆锯片精密锯床通常用于板材生产的最后一道工序 ．就是 解决方法 ：在锯切头尾料时要做到少切慢切 ．减少板材发热 将生产 出来 的板材按照用户 的要求切割成各种规格 的成 品然后 和内部应力对锯片的影响 必要时要把板片固定在料架上 ．防止 包装发货 因此锯切的质量将直接影响到板材的成品率 如果此 在锯切过程中窜动损坏锯片 时出现锯切跑偏将会产生板片短尺 、斜边等废 品．造成不可挽 回 4、切下的料头砸中锯片造成锯片变形 的难以处理的后果 。 金属板片在料架上的摆放位置也是很有讲究 的．要保证锯切 二 锯片跑偏原 因分析 下来 的边角料掉下时不能砸着锯片 如果金属板材在料架上的 1、锯头定位装置失效 摆放位置不合理 ．会造成料头被切掉后不是 向外侧翻倒 ．而是 锯头在工作位置的定位是靠锯头座上 的定位桩和定位螺栓 倒 向里侧砸 向锯片 当比较重 的料头砸在非常快速地旋转 的锯片上时． 来实现的 如果定位桩和定位螺栓的基准位置发生了变化 ．定位 极容易造成锯片掉齿、卡死和变形 ．从而造成锯切跑偏 。 就不准确 ．造成 了锯切时锯片跑偏 这是因为 ．锯床在生产的全部过程 解决办法 ：在摆放板材时．要尽量使锯切的部位处在料架木 中．要多次地对板片进行横切和纵切 ．以便生产 出不 同规格的产 方的外侧 。这样可 以使切割下来 的料头倒 向锯片的另一侧 ．落在 品．所以锯头要经常地往复旋转90o角 。每转动一次，定位桩都要 料架的空档中．避免砸到锯片 和定位螺栓碰撞一次 由于经常的碰撞 ．定位桩和定位螺栓就会 5、锯切速度过快 发生松动、磨损甚至脱落 。这样锯头的定位基准就发生 了变化导 如果所锯切 的金属板材硬度和内部存在的应力都比较大 ．料 致锯头偏离基准位置 ．造成 了锯片跑偏 又 比较厚时．应该适当降低锯切速度 因为锯切速度和发热量是 解决办法 ：锯头在工作 中有的横切和纵切两个工作位置 ．所 成正 比的．切速过快时产生的大量热量使锯片过度发热膨胀 ，出 以定位装置也有两套 ．分别是横切定位桩和纵切定位桩 。并分别 现夹锯现象 ．从而引起锯片掉齿和变形 ．造成锯切跑偏 有相应的定位螺栓 。如果锯片在锯切时出现了跑偏 ，就要首先检 解决办法 ：控制锯切速度 ．尤其是在锯切 比较厚 的硬质合金 查相应位置的定位桩和定位螺栓 ．看它们是否松动、变形或脱 厚板时更是如此 在特殊情况下需要提高锯切速度时 ，可适量增 落 如果有上面讲述的情况发生 ．就需要紧固好定位桩 、更换定位螺栓 ， 加锯片冷却液流量 ．加强锯片 的润滑和冷却效果 ，达到正常锯切 然后换上新的锯片 此时锯片不要开动 ．用百分表触头打在锯片 减少跑偏 的目的 上．使锯头行走观察表的指针偏移情况 ．以此来测量锯头的实际 6、锯片缺齿或齿破损 位置与基准位置的偏差数值 经过多次测量和调整定位螺栓 ，当 锯片缺齿或齿破损也是造成锯片在生产 中跑偏的主要原 因 百分表的指针偏差在正负 O．05毫米 以内时．表明锯头已经处在 之一 使用这样的锯片进行板材锯切 ．相 当于增大了切屑速度和 基准位置 ．锁紧定位螺栓即可 加工切削量 ，增加了锯片的工作负荷。锯切中锯片受到来 自板材 2、锁紧机构失效 的作用力如果是倾斜和不均匀的．迫使锯片逐渐倾斜 ：缺齿位置 锯头旋转到基准工作位置定位后 ．还需要锁紧机构锁紧才 的不对称性也破坏了锯片在高速转动时的动平衡 。在这两方面 能工作 锯头的锁紧是 由两个水平方 向的锁紧液压缸的活塞带 因素的双重影响下非常容易导致锯片跑偏 动齿条、传动齿轮和锁紧螺杆来完成的。活塞杆伸 出时带动齿条 解决办法 ：更换锯片 前行和齿轮转动 ．齿轮又通过 内部的螺母带动锁紧螺杆使锯头 7、锯片侧面粘有烧结金属 向上移动贴上锯头座 ．通过二者之间的摩擦力来实现锁紧。如果 锯片在长时间工作后发热 比较大 ．此时如果锯片的润滑冷却 齿条与齿轮之间有金属屑等异物而卡住 ：液压系统的压力值没 效果不好 ．那些掉在锯缝 中的金属屑 ．有很大的可能性在高温和剪切力 有达到工作要求 ：锯头与锯头座结合面之间有油污或金属屑没 的作用下变成烧结金属粘在锯片上 当锯片侧面粘有这种烧结 有清除干净 ．这一些因素都可能会导致油缸活塞杆伸出不到位，引 金属时．锯片在工作时中受到的摩擦力大幅度提升 ，摩擦产生 了更 起锁紧螺杆 的提升力降低 ．接触面摩擦力下降等后果，最后导致 多的热量 ．导致烧结金属也越积越多 ．受到来 自板片的挤压力也 锯片在工作时跑偏 慢慢的变大 ．结果导致锯片倾斜和变形，造成锯切跑偏 。 解决办法 ：通过压力表检查液压系统的压力值是不是正常。如 解决办法 ：清除粘附在锯片上的烧结金属或更换新锯片。 果压力低 ．首先要检查油泵和溢流 阀等液压元件是不是正常好用 ， 8、锯片主轴传动带松弛磨损 油过滤器和油管路是否堵塞 ．油箱是否缺油等情况 ．查出故障原 锯床主轴传动三角带在经常使用后．会出现磨损和拉长的情 因并处理好 清除齿条与齿轮之间、锯头与锯头座之间的金属屑 况 ．变得松弛无力 ．大幅度的降低 了皮带的传动力矩 。由于锯片转速 和油污．然后反复旋转锯头几次锁紧后观察．如液压系统压力值 的不稳定和丢转 ．易引起锯片卡死和变形 ．不但影 响生产效率 达到一定的要求 ．锁紧油缸活塞杆伸 出到位 ．锯头与锯头座之间的结合 和产 品质量 ．也造成 了锯片跑偏 面严密无隙即可 3、板材夹锯造成锯片变形 解决办法 ：按时换传动_二角带 在切割金属板片 ．尤其是较厚的头尾料时 ．极有可能会出现板片 随着我 国金属生产加工业 的迅猛发展 ．机械加工设施在其 中 夹锯的故障 是因为头尾料一般表面都 比较硬 ，金属 内部的应 发挥着慢慢的变大的及其重要的作用。实践证明，只有加强设备人员的责 力也很大 ．而且板片弯曲变形不规整 。在锯切这些料时，锯片容 任心意识好专业方面技术知识 的学习．才能最大限度 的避免设备故障 易发热 ．体积热膨胀较大 锯切过程 中随着金属内部应力的逐渐 的发生。万一出现故障．只要正确分析原因，采取针对性措施 ，就 释放开来 ．板片如果发生变形 ，就非常容易导致夹锯产生锯片变形 能恢复设备的 良好工作性能．确保设备安全稳定运行 。 224 C H I N A V E N T U R E C A P I T A L 热带作物学报 2014，35(10)：1969—1974 ChineseJournalofTropicalCrops 番茄S1ARF2基因表达模式及其 在果实发育中的功能分析 杨 枭，任振新 ，林冬波，先志强，李正国 妻重庆享市高校功能鑫基篙因蔫与簧调控囊新技术重点实墓验室 重王庆400030 摘 要 为 了分析 SlARF2基 因在番茄生长发育过程 中的功能．利用定量 PCR技术分析 SlARF2基 因的表达模 式，发现SlARF2基 因在番茄花芽中表达量最高，在幼果 中次之 ，说明SlARF2基 因可能在番茄花果发育中起着 重要作用。为进一步研究 SlARF2的功能 ，构建 S1ARF2基 因超表达 、抑制表达载体 ，农杆菌介导转化番茄成功 获得了相应转基 因植株 。通过与野生型番茄植株花 、果不 同时期 的表 型进行 比对分析 ，发现 SlARF2基 因的超 表达对花的形态学特征无明显影响 。但能够显著提高植株的结实率、降低果实大小和重量。说明 sA／RF2基因 参与调控番茄花、果发育过程 。 关键词 番茄 ；SA／RF2；表达模式 ；果实发育 中图分类号 $641．2 文献标识码 A TheExpression Pattern ofSIARF2 in Tomato and the FunctiOn Analysisin Tomato FruitDevelopment YANG Xiao，REN Zhenxin，LIN Dongbo，XIAN Zhiqiang，LIZhengguo GeneticEngineeringResearchCenter,SchoolofLfieSciences，ChongqingUniversity／KeyLabofFu~twndGene andNewRegulationTechnologiesof ChongqingMunicipalEducationCommission,Chongqing400030,China Abstract To investigate thefunction ofSbtRF2 in tomato development，weanalyzed the expression pattern of S 足 by Real—time PCR．We ofund thatS／ARF2 washighly expressed in tomato bud and immature fruit． suggestingthatSlARF2playsan importantroleintomatoflowerand fruitdevelopment．Furthermore，we constructed SlARF2 overexpression and suppress expression vectors．By agrobacterium infection，we finally obtained the SlARF2 overexpression and suppress transgenetic tomatoes．Compared the transgenetic tomatoes to wild type tomato，we found thatSlARF2 had no affection in hte morphology offlower，however SlARF2 overexpression strongly enhanced the rape rate oftomato and decreased hte size oftomato furit．1’I1e study demonstrates that SlAR1；2 regulates hte developmentoftomato flowerand furit，and providesbasic reference forfurtherstudy of ．s F2 function． Key words Tomato；SlARF2；Expression pattern；Furitdevelopment doi 10．39690．issn．1000—2561．2014．10．015 生长素是植物生长激素 中最为重要 的一种激 拟南芥、土豆 、水稻、葡萄ARF家族成员的蛋 白 素．通过调节早期生长素响应基因的表达 ．调控植 质序列 比对分析 ．建立系统进化树 ．将ARF家族 物生长发育的多个阶段如 ：顶端优势、向性生长 、 划分为 四个分支 。其 中。ARF Ia。IIb，IIIand 侧根 的形成、微管的分化、胚胎发育等[1]。在早期 IV 亚家族基 因的蛋 白中间区域含有一个抑制功能 生长素响应基因的启动子区域包含一个保守的顺式作 域 ．推测这些亚家族 的ARF蛋 白为转录抑制子 。 用元件 TGTCTC．称为生长素响应元件 (AuxRE)园。 ARF2基因属于 ARFIa亚家族成员 ．作为一个潜 能够与该元件结合并调节生长素响应 的一种转录因 在的生长素负调控转录因子 ．已经在多种模式植物 子称为生长素响应因子 (auxinresponsefactorARFs) 中被克隆研究。在拟南芥 中， 突变体表现出对 ARFs是植物生长素信号途径 中一个重要的转录因 植物生长发育多向性 的调节影 响，包括植株变大、 子 ．它正向或者反 向的调控生长素相关基因的表 组织形态异常等[61ARF2基 因在植物生长发育的 达 ，从而调控植物生长发育过程3[]。通过对番茄、 多个阶段都有表达 ， 突变体在植物衰老的多个 收稿Et期 2014—04—20 修 回日期 2014—09一O1 基金项 目 国家863课题 (N0．2012AA101702)；国家 自然科学基金(N0；重庆市重点自然科学基金项 目(No．2011BA1024)；教育部 博士点基金 (No．029)。 作者简介 杨 枭 (199O年一)，男，硕士研究生；研究方向：植物激素信号转导。}通讯作：i~(Correspondingauthor)：李正国(LJZhengguo)， E-maih ．cn。 一 1970- 热 带作 物 学报 第 35卷 过程中均表现出明显的延迟现象，包括花的脱落． Template≤200ng．PrimeSTAR HS DNA Polymerase 叶的衰老以及角果 的成熟 。有研究发现 ．arf2突 0．5 L，加 ddH2O至 50 L。PCR产物经胶 回收后 变能促使组织细胞分裂增强， 突变株系中。茎 连接至 pEASY—Blunt克隆载体 。测序验证 测序 和莲座 中与细胞周期相关的 CYCD3；基 因和与细 结果通过 DNAMAN软件与拟南芥ARF2基 因序列 胞分裂相关的ANT基因表达时期都被相应的延长． 比对进行相似性分析 ．通过 NCBIBlast进行蛋 白 说明AR 是一个细胞分裂和组织发育的抑制因 序列结构功能域分析 子8[]。ARF2还介导生长素与其他植物激素的互作 1．2．2 组织表达模式分析 Triz0l法提取番茄各组 乙烯可 以通过蛋 白酶体途径介导ARF2蛋 白的降 织器官总RNA，组织器官分别为根 (R)、茎 (S1、叶 解 ．并且该过程与 乙烯促进生长素的合成途径是相 (L)、花芽(B)、花(FL)、幼果(IM)、绿熟(MG)、黄果 互独立的[9．101在生长素和 ABA交互通路 中ARF2 (YF)、红果 (Re)。OD 0D2 1．8~2．0，以2I．LgRNA 与HB33作为新型的调控因子 ．对植物生长起着重 为模板 ．经DNaseI消化 30min后反转录合成第 要的调控作用n【] 油菜素 内酯 (BR)调控通路 中的 — — 链 cDNA，以弓I物ARF2一F，ARF2一R，SlActin—F， 重要基因BIN2磷酸化会导致ARF2的DNA结合和 SlActin—R[1】](表1)分别扩增 目的基 因和 内参基 因 抑制能力缺失 ．BIN2通过钝化 ARFs增强生长素 按照 MaximaSYBR Green／FluoresceinqPCR Master 诱导基 因的表达 [12】。ARF2对番茄生长与发育具体 Mix(2X) 125 L，ForwardPrimer0．3wmol／L，Reverse 的调控功能．尤其是对花和果实发育的作用至今仍 Primer0．3~mol／L，cDNA≤100ng．力ⅡddH20至 不清楚 。本文以番茄 IsIARF2基因作为研究 目标 ． 25 L反应体系进行扩增反应，为了确保结果的可 分析其在番茄花与果实发育中的功能 ．以期为明确 靠性 ，每个反应设置 3次重复。PCR程序设置为 ： 番茄 SIARF2的发育调控功能奠定基础 50℃ 2min；95oC 10min；95cI= 15S，60oC 30S， 72℃ 30S．40个循环。PCR扩增结束后立即进行 1 材料与方法 熔解曲线分析．以验证扩增的特异性 熔解 曲线cc开始 1．1．1 植物材料 番茄 ‘册z册 lycopersicum．CVMicro 每升高 0．5℃保持 10S．连续升高 80次 。数据处 Tom)、大肠杆菌 JM109和农杆菌 (Agrobacterium) 理 ：实 时荧光定量 PCR反应完成后 ，iCyclerMT 菌株 C58由本实验室保存 softwareversion3．0自动计算出各个板位的CT．将 1．1．2 试剂 T4DNA连接酶 、限制性 内切酶及反 CT值输入到Microso~Excel2003中．按照公式△ 转录试剂盒购 自Fermentas公司 (USA)，PrimeSTAR ACT=[(C Target-CT Reference)sample A-(cr 高保真 DNA聚合酶购 自TaKaRa公司(大连)，质 Target—CTReference)sampleB11l【3】，采用 2-AACT法分 粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购 自OMEGA 析定量数据 ．计算基因的相对表达量 ．并绘制基因 公司(USA)，总RNA抽提试剂Trizol购 自Invitrogen 表达差异 的柱形图。其 中．CTTarget表示 目的基 公司(USA)，其他生化试剂购 自鼎国生物技术有限 因的CT值 ．CTReference表示内参基 因的CT值 公 司f北京 1，Real—timePCR所 用 试剂 Maxima⑧ 表1 本实验所用到的引物序列 SYBR Green／FluoresceinqPCR MasterMix(2X)购 自 Table1 Theprimesusedintheexperiments Fermentas公司(USA)，用于番茄组织培养的MS培 养基购 自Sigma公司：所有引物合成和测序工作均 引物名称 引物序列 5-3 由南京金斯瑞生物科技有 限公司完成 F1 CGCGGATCC(BamHI)An’AGTGTACGGAAATGGCTGC R1 GGCTCTAGA(XbaI)CGTGATCCTAAGATTCTGCITI’G 1．2 方法 Fs CGCTC AGA(baI)AGACCGAG兀-FCACCGTGG 1．2．1 ARF2基 因的克隆及序 列分析 Trizol法提 Rs CGCGGATCC(BamHI)TCTCCCCGCATITGATAGG 取番茄各组织器官总 RNA，ODz~olOD~o=1．8～2．0， AR 一F GCAAGGTCAAGAGTrATCGA 以2 gRNA为模板 ，经 DNaseI消化 30min后 A 2一R CATTGGTITCTCAGACAAGTC 反转录合成第一链 cDNA(步骤参照说明书) 取各 SlActin-F TGTCCCTAITITI1ACGAGGGTTATGC 组织 cDNA等比例混样 ．以之为模板 ，以引物 Fl， JsM ctin—R AGITAAATCACGACCAGCAAGAT R1(表 1)，高保真DNA聚合酶扩增 ．s／ARF2基因。 加样 比例为 ：5xPrimeSTAR Buffer10lxL．dNTP 1．2．3 植物表达载体 的构建 克隆S1ARF2基 因 Mixture(2．5mmol／L1，引物1、2各 0．2～0．3Ixmol／L， 全长 时．在引物 F1的 5端设计加入 BamH I酶切 第 l0期 杨 枭等 ：番茄S RF2基因表达模式及其在果实发育中的功能分析 一197l一 位点 ．在 引物 F2 的 5端设计加入 Xb口I酶切位 1．2．5 植物表型鉴定 结实率=所收获的果实数／ 点。克隆得到具有 BamH I、XbaI双酶切位点的 开花数。番茄果实直径大小用游标卡尺测量。 全长基因。BamH I、XbⅡl双酶切处理 DCAMBIA一 1．3 数据处理 35S载体 。37qC，1h，胶 回收纯化。T4连接酶连 所得数据用 Excel进行方差分析 ．最小显著差 接 处理过 后的 S 基 冈片段 和 DCAMBIA一35S 数法 (LSD法)进行显著性分析，每个数据样本nI5， 载体 ，16oC过夜 ，转入大肠杆菌 菌落 PCR筛选 不同的字母代表差异显著 ， 代表差异极显著． 鉴定 阳性 克隆 ，提质粒 ，得 到 pCAMBIA一35S— 代表差异显著 S1ARF2超表达载体 。选取全长基因中约 600bD的 基因片段 ．设计 引物 Fs和 Rs．在 Fs的 5端设计 2 结果与分析 加 入 Xb I酶 切 位 点 ．在 Rs的 5端 设 计 加 入 2．1 A足F2基因的克隆与结构功能域分析 BamH I酶 切位点 克 隆得 到的基 因片段连接至 以番茄总 RNA反转录成的cDNA为模板 ．用特 BamH I、 6ⅡI双酶切 处理 的pCAMBIA一35S载 异性引物 F1和R1进行PCR反应 ，得到约2560bp 体。筛选阳性克隆，提质粒，得到pCAMBIA一35S— 的片段 (图 1一A) 将测序结果与数据库 中番茄 asARF2反义抑制载体 1．2．4 转基 因植株获得及鉴定 叶盘法转化番茄． SlARF2基 因 比对 ．确认 所得 片段为 ARF2基 因 经卡那霉素抗性筛选 ，GUS报告基 因染色筛选 ． 番茄A尺 基因与拟南芥 A尺 基因的蛋 白质序列 初步获得阳性转基因植株l14l转基因植物 S 尺 比对 ．相似性为 61．7％．2个基因都含有 3个明显 基因表达量鉴定 ：取各植株同一时期植株叶片提取 的 保 守 结 构 功 能 区 域 Domain I、Domain II、 RNA反转录 cDNA．以之为模板进行定量 PCR检 DomainIII(图 l—B)，这 3个保守结构功能域分别 测 (具体步骤见组织表达模式分析)．得到各株 系 为 B3一DNA结合 区域 、Auxinresponsefactor生长 ．sA／RF2基因表达量 ．以野生型 中LsA／RF2表达量 素响应区域以及AUX／IAA家族基因转录激活区域 ． 为 1。确定转基因植株是否超表达或抑制表达 属于典型的ARF家族保守结构功能域 A bp AtARF2seq脯孽 嚣爱 灌薏嗣_ 翻 hn (”‘ ““s ” 。 窜 。 = d 。iy 1 。#l ： 500o ARF2, 2560 t 30oO AR ． se圈重罾l蛋羹莲冒雷舞羞薏曩薯目匿薯薏聋薯鐾羞l Ij Co[1s{~nsus ：pq0 ：eqVea ： aqqxq=l p5 lc：V V lae0：deVYaqtl e：qde~a ke FF ：fvh 2000 AtARF2．seq 243 BIARF2．seq 225 Consensus sf k：lc^，卷：3tn口口t， 1r： ade0l 1衄 31a窄C0qtiv^kdlh nt zfzhlf=a口口r! lla3avSVfVS$~rIV lx【M】 750 AtARF2．seq 324 BIARF2．seq 3o6 Consensus AtARF2．seq 405 BlARF2．seq 387 Consensus tARF2． -ARF：． se,I嚣匿孽圜量重 墨耄薏 _ 薏善莲蘧霪墨酒耄童飘；222 IARF2． 。 ． se墨孽 塞墨葚I ：曩饕童疆 嚣疆重童溜耄渭 l ； IARF2．se 。 Fz． 。 誊亳 谭蘧篡羡强鬈曼蘧霪童蘧稍 鬈 凄 蓉 瑁643 IARF2．s ． 州eq善意懑；翟暖誉 器瓢 i圜薯■ 嚣誊 AtARF2．seq 795 BIARF2．seq ； 782 Consensus AtARF2．seq BIARF2．seq Consensus 图1 SfAR 基 因扩增及结构功能域分析 Fig．1 ThecloningandtheFunctionDomainanalysisofARF2Gene 一 1972一 热 带 作 物 学报 第 35卷 2．2 SIARF2植物表达载体的构建 表明，基因序列及连接方 向正确 。表 明成功构建 将带有酶切位点的S1ARF2全长基 因和 中间 了SlARF2超表达载体 pCAMBIA一35S—SIARF2和 片段 ．连接 至酶切处 理 的 pCAMBIA一35S植物 表 反 义 抑 制 载 体 pCAMBIA一35S—asARF2(图 2)。 达载体 ，转化 大肠杆菌 ，经 PCR、酶切验证 。 通过冻融法将成功构建 的表达载体转入农杆菌 确定 目的片段 已成功 的连接到载体 。测序结果 C58中。 pCAMBIA—-35S—-asARF2 图2 SIARF2植物表达载体的构建 Fig．2 TheconstructionofSIARF2expressionvector 2．3 SIARF2基 因在番茄各组织中的表达模式分析 育过程 中的功能 ．设计构建 ．S／ARF2基 冈的超表达 定量 PCR分析 SA／RF2的表达模式 结果发现 及反义抑制载体 ．通过遗传转化成功获得了4个超 在番茄根、茎 、叶营养生长阶段 S 尺 的表达量 表达转基 因株 系 ，ARF2—1、ARF2—3、ARF2—4、 呈明显的上升趋势．在根中表达最低 ．茎的表达量 ARF2—5和 1个反义抑制转基 因株系 As—ARF2 提 约为根中的 l0倍 ．叶的表达最高 ．约为根中的 13 取各转基 因植株 60d的叶片 RNA．反转录得 到的 倍 进人生殖生长阶段后的花芽期达到最高 ．约为 cDNA．定量 PCR检测各个植株 的转基 因表达情 根 中表达量的 17倍 ．花和幼果时期的表达量有所 况 。结果表明．转基 冈株系 ARF2—1、ARF2—3中 下降，为根 中表达量的 12倍左右 ．在果实发育阶 A尺 基因的表达量较高．约为野生型表达量的 13 段 Js／ARF2的表达量 明显下降并趋于平稳 ．为根 中 倍 ．ARF2—4植株 S／ARF2的表达量较低 ，约为野 表达量的 5～7倍 (图 3)。由此推测 Ls 基 因对 生型表达量的 7倍 ．ARF2—5植株 的Js R 表达 番茄花以及果实的发育形成具有调控作用 量相对野生 型无 明显变化 ．反义抑制植株 As— ARF2中5 R 基因的表达量 明显降低 ．约为野 生型中表达量的0．5倍 (冈4一A)。通过统计植物开 15 花期各转基因植株的开花数量．并与相同生长条件 下 同时期的野生型植株进行对 比．结果表明．开 圜 醐 l0 花期各转基 因植株的开花数量基本一致 (平均每 株 25朵左 右 )．证 明ARF2基 冈表达量的差异并 器 5 不能对花的形成产生明显的影响 在番茄幼果形成期 ．对各转基因株系的结实率 O 进行统计 ，结果显示：4个SA／RF2超表达转基因株 R：根；S：茎 ；L：11-r；B：诧芽 ；FI：花 ； 系的结实率明显高于野生型植株．其中ARF2—3株系 IM：幼果 ；MG：绿熟 ；YF：黄果 ；Re：红果。 的结实率最高 ．ARF2—5次之 ．ARF2—4和ARF2—1 R：root；S：stem；L．1eaf；B：bud；Fhflower；IM：immature MG：Maturegreen；YF：Yellowfruit；Re：redfurit． 相对于野生型植株也相应增高 ．As—ARF2反义抑 图3 番茄S RF2基 因表达模式分析 制株系的结实率明显低于野生型植株 (图4一B)．．证 Fig．3 ExpressionpatternofSIARF2intoma~ 明S 尺 基因的超表达对果实座果有着一定的促 2．4 刚 基因在果实形成发育中的功能分析 进作用。进一步对成熟期果实进行统计分析。结果 为分析番茄 ．s／ARF2基 因在番茄果实形成发 发现．各转基因株系的果实在数量 、大小以及重量 笫 10期 杨 枭等 ：番茄SfARF2基因表达模式及其在果实发育中的功能分析 一1973一 r兽 盟醐 《 目眦，÷ 涮林眯 上有着明显的差异 ARF2—加3的果实大m小、重量明O 大∞小、∞重量如的变加化成m明显0的线一E)。以 显小于其他各株系 。ARF2—4、ARF2—1株系 的果 上一数据表 明．随着 SlARF2基 因表达量 的提高 ， 实大小 、重量也明显小于野生型植株果实 。ARF2—5 转基因株系果实的大小和重量相应减小 株系以及 As—ARF2反义抑制株系的果实大小、重量 综上所述 ．在番茄果实发育过程 中SlARF2基 与野生型果实相比无明显变化 (图4一C、D：图5)。 因显著影响了植株的结实率 、果实大小和重量 ，证 同时S RF2基因表达量的变化与转基因植株果实 明A 基因是调控果实发育的一个重要因子 0-8 0·6 槲 04‘ O·2 0·0 1O 8 bo 面 6 4 2 0 大小) 重量 ) 20 I5 l0 5 O A：ARF2表达量 ；B：结实率 ；C：果实直径；D：果实重量 ；E：表达量与果实大小 、重量关系间的回归分析。 A：expressionquantitiesofARF2；B：ripeningrate；C：fruitdiameter；D：fruitweight：E：linearregressionanalysis． 图4 足 各株系果实表型分析 Fig．4 Analysisthephenotypeoffruit 一 l974- 热 带 作物 学报 第 35卷 异 ．同时各 S R 超表达株系的果实呈现圆润且 饱满 ．而野生型果实的底部明显尖细且果实呈心型 (图5)．这与同家族基因 5 尺 的研究具有一致 性I15_．从形态学分析 ．可能是 由于 SA／RF2直接影 响了番茄的细胞分裂所致 但结合结实率受影响这 一 结果 ．推测可能是因为5 R 基因在果实形成过 程中影响了营养的分配所致 ．对此尚有待深入研究 参考文献 【1]KumarR，Ty AK，SharmaAK，et ．Genome-widenaalysis ofauxinresponsefactor(ARF)genefamilyfromtomatoandanalysis oftheirroleinflowerandfruitdevelopment[J]．MolGenetC~nomics， 2011．285(3)：245—260． 2【】GuilfoyleTJUlmasovT，HagenG，eto1．TileARFfambYof transcription factorsand theirrole in planthormone—responsive transcriptionJ[]．CellMolLifeSci，1998，54(7)：619-627． 3【]GuilfoyleTJ，HagenG Auxinresponsehctors[]j．Curr()pinPlant Biol，2007，1O(5)：453-460． [4]TiwariSB，HagenG，GuilofyleT．Therolesofauxinresponse 图5 各转基 因株系番茄果实形状 factordomainsin auxin—responsive transcription[J]．PlantCell， Fig．5 ThecomparisonofeachTransgenictomatofruit 2003，l5(2)：533—543． 5【】MohamedZ，FuY，Chateigner—BoutinA L，eta1．Characterization 3 讨论与结论 oftheTomatoARF Gene Family UncoversaMulti-LevelsPost- TranscriptionalRegulationIncludingAlternativeSplicing[J]．Plos 本研究以番茄SIARF2基因为对象 。成功构建 One，2014，9(1)：1-12． 了Ls 尺 基因的超表达和反义抑制载体 ．并获得 [6】OkushimaY，MitinaI，QuachH L，eta1．AUXINRESPONSE 了相应 的转基 因植株作为后续分析材料 通过对 FACTOR2(ARF2)：apleiotropicdevelopmentalregulator[J]．Plant J，2oo5，43(1)：29—46． ．slARF2基因表达模式 的分析 ．发现 ．slARF2基 因 7【】EllisC M，NagpalP，YoungJC，eto1．AUXIN RESPONSE 的主要表达时期处于番茄的生殖生长阶段 ．从花芽 FACTOR1nadAUXIN RESPONSE FACTOR2regulatesenescence 开始贯穿于花 、果发育的整个过程中 通过对所得 andfloralorganabscissioninArabidopsis￡ JJ．Development， 2005．132(20)：4563-4573． 到的转基 因株 系材料的花 、果分析发现 ．SIARF2 [8]SchurffM CSpielman~ITiwaris，et以 TheAUXIN RESPONSE 基因在花蕾 中表达量最高 ．在开放仡中表达量也较 FACTOR 2 geneofArba idopsislinksauxin signalling,celldivision, 高．但对花的形成并没有产生非常明显的影响 在其他 andthesizeofseedsandotherorgans[J]．Development，2005， 133(2)：251-261． 研究中。拟南芥 arf2突变株系 中会表现 出花形态 9【】LiH，JohnsonP，StepanovaA，etrJ』．ConvergenceofSignaling 异常 ，开花延迟和花序长而密集的表型[51。因此 ， PathwaysintheControlofDifferentialCellGrowthni Ambi~sis[J]． 为了明确 LslARF2基因在番茄花形成 阶段 的功能 ． DevCell，2004，7(2)：193—204． 还要进一步对所得到的转基因植株开花时期的对 [10]RuzickaK，LjungK，VannesteS，eta1．Ethyleneregulatesroot gmwth Ⅱ effectson auxin biosynthesisnad trartsporl—dependent 应生理生化指标进行研究 auxindistribution[J]．PlantCell，2007，19(7)：2197—2212． 本研究通过对转基因植株的SlARF2基因表达 [11】WangI，HuaD，HeJ，et ．AuxinResponseFactor2 (ARF2) 量 ．结实率以及成熟后果实的统计分析．发现各植

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